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          1. 環境微生物測序分析
            微生物群落多樣性--擴增子測序
            【添加時間:2016-07-20 14:13:08】【來源:】【作者:weiliang】
                環境樣品的單基因擴增子測序,主要是利用HiSeq/MiSeq平臺對原核16S rRNA、真菌18S rRNA、真菌ITS、功能基因擴增子測序??蛻糁恍枰峁└哔|量的DNA樣品,由專業人員進行PCR擴增及上機測序,獲得環境樣品中單個基因的組成和多樣性信息。

                16S rRNA是目前最常用的生物標志物,廣泛應用于微生物的系統進化、分類及多樣性研究中。16S rRNA占細菌總RNA量的80%以上,基因序列長短適中,其結構中既有保守區域,又有變異區域,是較好的生物標志物。人們根據16S rRNA基因不同區域序列的可變性將其分為9 個可變區和9 個保守區(圖1)

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                圖1 16S rRNA 基因保守區和可變區的分布

               擴增子測序實驗流程如下:
                1. 基因組DNA提取
                不同樣品性質不一樣,提取DNA的方法會有差異。對于土壤DNA提取,推薦使用PowerSoil® DNA Isolation Kit,該試劑盒也可以提取糞便、腸道內容物等樣品。
                2.  PCR
                根據保守區設計帶barcode的引物,以DNA為模版進行PCR擴增。
                3. PCR產物純化和定量
                PCR產物進行膠回收純化,然后定量產物濃度。按照每個樣品的測序量要求,進行相應比例的混合。
                4. 文庫構建及上機測序
                根據產品說明書構建文庫,并上機測序。
             
               
                 擴增子測序數據分析方法見“生物信息學服務”。
               
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